分子診斷中PCR和mNGS在傳染病診斷領域的應用
分子診斷技術主要分為PCR技術、原位雜交技術、核酸質譜及基因測序。而在傳染病檢測領域，PCR技術和基因測序應用更加廣泛。
1）PCR技術檢測速度快，市場份額大。在傳染病的診斷和血篩方面，基于PCR技術的分子診斷能縮短診斷的窗口期，并且可以定量對病原體進行檢測。相比于傳統(tǒng)的免疫診斷方式而言，有不可替代的優(yōu)勢。所以，基于PCR的分子診斷往往是醫(yī)院對傳染病診斷的最后“金標準”也是應用最廣泛的分子診斷技術，占據(jù)最大的市場份額。
2）NGS通量大，效率高，正在高速發(fā)展并不斷占據(jù)市場份額?；驕y序目前已進入二代測序（NGS）時代。NGS擁有高通量、無需培養(yǎng)、高敏感度、能夠鑒定未知病原體及罕見病原菌等優(yōu)勢，在傳染病的預防和控制中發(fā)揮著重要作用。
PCR診斷
1、現(xiàn)狀
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，利用DNA在體外攝氏95°C高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5′-3′)的方向合成互補鏈。PCR診斷就是基于PCR技術完成病原體基因片段的擴增，從而確定樣本中病原體的存在，實現(xiàn)患者的確診。
PCR技術易操作，臨床應用程度高。從PCR技術發(fā)明至今已過30年，而PCR技術也發(fā)展到第三代。PCR技術在醫(yī)學檢驗學中最有價值的應用領域就是對傳染性疾病的診斷，既可以選擇病原體基因中的保守區(qū)做通用檢測，也可以選定差異較大的基因部分做分型檢測，而且檢測的靈敏度和特異性都遠遠超過當前的免疫學檢測方法，所需時間也可達到臨床要求，尤其適用于難以培養(yǎng)的病毒、細菌和原蟲等。目前主要運用的是第二代和第三代PCR技術。1）第二代PCR。第二代PCR就是熒光定量PCR技術（Real-Time PCR），也叫做qPCR。熒光定量PCR通過在反應體系中加入能夠指示反映進程的熒光探針，通過熒光信號的積累來監(jiān)測擴增產(chǎn)物的積累。目前常用于傳染性疾病病原體檢測、疾病耐藥基因研究等方面。該技術操作流程更簡單，經(jīng)濟高效，需要的DNA和RNA加樣量少，不過也存在易污染的問題，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。如本次疫情中研發(fā)的試劑盒就有部分使用了PCR技術，根據(jù)檢測結果來看，也有部分試劑盒出現(xiàn)了假陽性的反應。2）第三代PCR。第三代PCR技術叫做數(shù)字PCR（Digital PCR, dPCR, Dig-PCR），這是目前全新的一種PCR檢測方式，能對核酸進行檢測和定量，采用直接計數(shù)目標分子而不依賴任何校準物或者外表，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數(shù)目。相較于二代技術，數(shù)字PCR靈敏度更高，定量更準確，抗干擾能力更強，但是對模板質量和引物特異性要求較高。目前數(shù)字PCR技術可用于檢測病毒感染和細菌、HIV病毒潛伏庫監(jiān)測、殘留病毒載量等。
2、市場規(guī)模
感染性疾病領域臨床需求穩(wěn)定，PCR診斷規(guī)模達十億級別。根據(jù)火石創(chuàng)造的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，近年全球分子診斷行業(yè)年均增速約為11%，而我國分子診斷行業(yè)年均增速則達到了24%，為全球增速的兩倍。PCR作為分子診斷極其重要的組成部分，由于臨床需求推動PCR診斷穩(wěn)步放量，預計2021年市場規(guī)模達53.4億元。根據(jù)測算，基于PCR平臺的感染性疾病發(fā)病人數(shù)有望從2017年555.30萬人/年增加到2021年的577.84萬人/年，應用PCR平臺產(chǎn)生的診斷費用有望由2017年的13.88億元增加到2021年的14.45億元。在血篩方面，根據(jù)衛(wèi)計委相關數(shù)據(jù)，全國無償獻血人次從1998年的5萬人次增長到 2013 年的1278萬人次，增長了近256倍。由于艾滋病、肝炎等傳染病主要通過血液傳播，受血者一旦輸入了感染了病毒的血液，被感染的概率接近100%，危害性極高，因此對血液安全檢測擁有強烈的剛性需求。我國開始于2010年的血站系統(tǒng)核酸檢測（NAT）試點工作將在未來繼續(xù)推廣，根據(jù)我國的獻血人次，至少將帶來每年1200萬人份左右用于血源篩查的核酸檢測試劑市場需求?；赑CR平臺的血篩市場規(guī)模有望由2017年的4.09億元增加到2021年的6.21億元。
3、競爭格局
PCR儀器市場目前仍由國際廠商主導。在三級醫(yī)院高端PCR儀器市場中，國際廠商仍占據(jù)主流。國內(nèi)市場上約有PCR儀器廠商數(shù)十家，進口品牌包括賽默飛、伯樂、羅氏等，國產(chǎn)廠商則包括西安天隆、杭州郞基、珠海黑馬、杭州博日、上海領成等，進口品牌約占市場總量的70%以上。國外代表企業(yè)的PCR儀器價格每臺在3萬元到9萬元之間，國內(nèi)企業(yè)獲批的PCR儀器主要在技術水平要求相對較低的核酸提取/純化儀及PCR擴增儀領域，價格則每臺在2.6到2.8萬元之間，國產(chǎn)PCR儀器具有明顯的價格優(yōu)勢，因此國產(chǎn)PCR儀器在二級及以下醫(yī)院布局具有很大優(yōu)勢。
PCR試劑基本實現(xiàn)國產(chǎn)化，國內(nèi)多家企業(yè)布局PCR產(chǎn)品。PCR試劑可分為核酸提取試劑及核酸診斷試劑，由于PCR檢測系統(tǒng)多為開放式，試劑研發(fā)技術門檻較儀器低，國內(nèi)廠商憑借在價格及渠道方面的優(yōu)勢，PCR試劑已基本實現(xiàn)國產(chǎn)化。目前針對常見傳染病的檢測，如乙肝、丙肝、艾滋病等，多家國產(chǎn)企業(yè)研發(fā)了試劑盒，包括華大生物、之江生物、圣湘生物、邁克生物等企業(yè)，國內(nèi)生產(chǎn)廠家數(shù)均遠大于國外廠家。甲型、乙型、丙型流感等常見疾病的核酸檢測試劑盒也已經(jīng)比較成熟，競爭廠家較多，幾乎全部為國產(chǎn)品牌。
mNGS
1、現(xiàn)狀
mNGS是感染性疾病診斷的重要技術。對于基因測序而言，其對于病原體的篩查，不僅限于傳染性疾病，而是在整個感染性疾病范圍（感染性疾病包括傳染病以及其他不具備傳染性的病原體感染性疾病）。感染類疾病的檢測重點在于檢出率、時效性、功能指標分析和對于未知病原的快速定性分析能力，傳統(tǒng)檢測手段存在病原體培養(yǎng)周期長、成功率低、功能指標分析能力不足和難以做到廣譜檢測的缺點，而基因測序則為解決這些問題提供了一個新的途徑。目前主流的基因測序技術是二代測序(Next-generation Sequencing ,NGS)，當NGS技術用于感染性疾病檢測時，NGS會測出樣本中所有的微生物，而不是像PCR那樣只有單一靶標，同時也無需提前獲悉待測病原體的序列信息，所以此時NGS也被稱為mNGS（meta-genomics NGS）。
基因測序檢測范圍廣，效率高，在傳染病檢測中mNGS為主流技術。目前，基因測序平臺已經(jīng)出到了第三代，但是三代測序準確率仍然不夠高，成本也較高昂，因此NGS仍然是主流。目前mNGS使用的技術中以羅氏公司的454技術、Illumina公司的Hiseq技術和ABI公司的Solid技術為代表。
2、市場規(guī)模
mNGS市場規(guī)模大，行業(yè)仍處于發(fā)展期。據(jù)WHO對2015年全球死亡原因統(tǒng)計，全球因感染死亡的人數(shù)將近1000萬，占全部死亡原因的17%。根據(jù)億歐網(wǎng)的數(shù)據(jù)，目前美國感染類疾病的診斷市場總規(guī)模為180億美金，預計在2022年基于mNGS的感染類疾病診斷市場將達到50億美元。根據(jù)IMS公司的數(shù)據(jù)，在我國感染性疾病的發(fā)病率為120-250人/10萬人，微生物送檢量約5000萬份，其中血培養(yǎng)約4000萬例/年，肺泡灌洗液BALF約100萬例/年，腦脊液及其他體液約50萬例/年。另外，隨著腫瘤患者生存期顯著增長，超過30%腫瘤患者死于復雜感染?；谝陨蠑?shù)據(jù)，當檢測價格降至2000-2500元區(qū)間，目標市場檢測量保守估計為500萬份/年，約為100億人民幣。mNGS的高通量和廣覆蓋性使得其在混合感染和未知致病微生物的檢測方面具有巨大優(yōu)勢。2019年復旦大學附屬中山醫(yī)院的胡必杰團隊研究結果顯示，mNGS具有更高的病原體鑒定靈敏度，受抗生素的影響較小，因此具有檢測傳染疾病的潛力及臨床意義。因此，可以預計mNGS擁有巨大的潛在市場。
3、競爭格局
多家企業(yè)布局，行業(yè)發(fā)展態(tài)勢良好。mNGS在2014年第一次在臨床上成功應用于病原體的診斷，行業(yè)發(fā)展歷史較短，但是mNGS已經(jīng)受到業(yè)內(nèi)關注，在各種展會和學術會議上都能看到mNGS的宣傳和討論，布局 mNGS的企業(yè)也日漸增多。國外代表公司有IDbyDNA、Karius，國內(nèi)公司有華大基因、博奧生物、達瑞生物、賽哲生物、微遠基因、金域醫(yī)學、金匙基因等數(shù)十家企業(yè)，行業(yè)發(fā)展勢頭火熱。不過關于mNGS在微生物領域的應用，目前全球還沒有相關領域的注冊試劑獲批。國外是通過LDT的方式開展,國內(nèi)目前處在方法學的標準品驗證階段，由中檢院負責，華大基因、博奧生物、達瑞生物和賽哲生物四家公司是第一批參與標準品驗證的公司。其中華大基因用自己的BGISEQ測序平臺，博奧生物、達瑞生物兩家用Thermo Fisher的NGS平臺，賽哲生物用的是Illumina平臺。
化學發(fā)光、PCR與mNGS在傳染病診斷領域相輔相成
1、化學發(fā)光
從便捷程度而言，化學發(fā)光相比分子診斷整個檢測過程耗時更短，價格更低，并且化學發(fā)光儀器相比分子診斷儀器在醫(yī)院中的普及度更高。如目前醫(yī)院術前八項檢查較多的使用化學發(fā)光技術，其價格遠低于使用分子診斷方法，靈敏度可達到要求，檢測得到結果的速度也更快。
從應用范圍來講，由于化學發(fā)光應用免疫診斷原理測血清樣本中的特異性抗原，其原理決定著化學發(fā)光無法被分子診斷替代：1）從取樣而言，化學發(fā)光取得是血清樣本可避免取其他樣本的操作不規(guī)范問題。對于比如新冠病毒等下呼吸道感染疾病而言，化學發(fā)光可避免核酸檢測中由于取樣困難及不規(guī)范而導致的假陰性問題。2）傳染病疫苗的抗體檢查，僅可使用免疫診斷的方法。如乙肝疫苗的有效期是五年。由于每個人的身體狀況不一樣會導致乙肝抗體存活時間不同，因此再次接種乙肝之前需做乙肝病毒抗體檢測，還可檢查抗體滴度，這時化學發(fā)光的診斷方法成為了最佳選擇。
然而化學發(fā)光基于免疫的原理也有一定的局限性：比如其要求被檢測的抗原或抗體具有特異性，而往往人體內(nèi)出現(xiàn)特異性抗體時，患者已經(jīng)患病較長時間，傳染病患者可能在不知情時已經(jīng)完成疾病對于周圍人群的傳播，因此該診斷手段對于早期傳染病患者的確診可能無法起到太大作用，對于傳染病的早期發(fā)現(xiàn)和遏制作用也有限，往往更適用于已表現(xiàn)出明顯癥狀的患者的確診。
2、PCR
從便捷程度而言，PCR的整個檢測過程耗時（樣本采集、預處理、上機檢測、報告）過程介于化學發(fā)光和mNGS之間，價格也相比mNGS要低的多，靈敏度相比化學發(fā)光或較高。此外對于本身擁有PCR實驗室的醫(yī)院，在二者皆可選的情況下，或更有動力做PCR檢測而非將mNGS檢測外包。
從應用范圍來講，PCR技術相比化學發(fā)光或擁有更多優(yōu)勢：1）分子診斷更適用于傳染病早期的大規(guī)模確診。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。PCR對病原體的檢測解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。因此，考慮到傳染病防治的關鍵點之一在于早期對于疾病的迅速確診，PCR技術更適用于傳染病早期的大規(guī)模確診，可以克服免疫診斷的滯后性和基因測序的復雜性。在本次新型冠狀病毒肺炎疫情中，通過NMPA審批的試劑盒也以PCR試劑盒為主。2）分子診斷可對病毒分型。如目前HPV診斷主要應用PCR技術，PCR可以鑒定特殊的HPV型別以及變異株，并對其進行針對性的處理，更有效預防宮頸癌。3）PCR可確定病毒載量。在抗病毒藥物治療監(jiān)測的過程中，病毒載量是判斷藥物療效的重要指標。如HIV的藥物載量測定需通過PCR來測定血液中HIV RNA的量，通過藥物載量的高低變化可幫助判斷HIV藥物效果。
PCR有一定的局限性：將PCR技術運用于傳染病的臨床檢測也容易出現(xiàn)假陽性和假陰性的問題，原因就在于樣本可能受到污染或者檢測過程中操作不當。因此，PCR診斷要求在高標準的實驗室條件下進行，以此提高檢測結果的準確性。
3、mNGS
mNGS擁有具有無需預先培養(yǎng)樣本、靈敏度高、高通量等優(yōu)勢，未來發(fā)展前景非常廣闊。但與此同時，由于起步晚，目前有著價格貴、普及度低等問題。
從應用范圍來講，mNGS對新發(fā)的、疑難的感染病能夠指明方向：1）mNGS檢測覆蓋范圍廣。相較于病原學診斷與常規(guī)的培養(yǎng)，mNGS沒有偏移性，即不會由于標本中存在多種病原體而導致病原學診斷的偏移性，檢測范圍覆蓋廣，可以同時培養(yǎng)多種病原體，效率高。因此mNGS在確診混合感染病人病原體和在常規(guī)實驗室檢查中未能發(fā)現(xiàn)病原體的患者的治療上具有優(yōu)勢，不僅可以用于新型傳染病早期大規(guī)模爆發(fā)時迅速完成病原體基因測序，鑒定新的病毒株，促進有效藥物和疫苗的探索和研發(fā)，也可用于早期低病毒含量樣本的檢測或實時熒光RT-PCR檢測可疑或灰區(qū)結果的確認。2）mNGS可以彌補RT-PCR的缺點，并能監(jiān)測病毒傳播過程中可能的變異，同時對于部分病毒含量較低的樣本，mNGS可以提高檢測陽性率。3）mNGS也可以在病原培養(yǎng)后做深度的二代測序，甚至全基因組分析，為預防以后同類型傳染病的爆發(fā)積累經(jīng)驗。
不過，mNGS技術目前有一定限制：在檢測過程中，樣本容易受到人源干擾，導致檢出率下降，而且mNGS的技術原理決定了它只能先測序后分析，所以上機測序這一步的時間開銷始終無法跳過，導致該項技術的時效性打了折扣。
4多種手段互相補充，提高檢測效率和準確性
傳染病的檢測和治療往往不是一個短暫的過程。上述提到的檢測手段各有其優(yōu)缺點，目前尚未有一種檢測手段在成本、耗時、準確度等方面都占據(jù)優(yōu)勢，它們的適用階段和范圍也各有不同。但是毫無疑問，在整個傳染病檢測和防治的鏈條中，醫(yī)生可以根據(jù)實際需要來選取合適的檢測手段。如像本次傳播速度極快的新冠肺炎就可以通過PCR診斷來迅速確定患者，完成密切接觸者的隔離；但是PCR診斷假陽性時有發(fā)生，為了提高檢測準確率，抗原和抗體檢測試劑隨后被研發(fā)出來，結合使用；NGS則被用來測定病毒基因序列，尋找有效藥物、進行耐藥性分析和疫苗研發(fā)?？梢?，傳染病的檢測和防治過程是緊密聯(lián)系的，為了保證執(zhí)行過程的高效性和準確性，多種檢測手段的互相配合和補充是有必要的，或許未來隨著技術的發(fā)展，某種檢測手段可以取代其他手段，但是在近幾年內(nèi)，我們相信多種檢測手段仍會并存，互相配合。
來源：廣證恒生 作者：胡家嘉
編輯：As素 | 校對：Ryan | 責編：友凡
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